Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Статьи » Геномная дактилоскопия » Приготовление зонда на основе гена 111 фага М13

Тандемные повторы М13 локализуются в положениях 1700–1900 и 2300–2500 фагового генома. Можно использовать эти данные и свойства фагового вектора для синтеза гибридизационного зонда с высокой удельной активностью. После отжига 17-нуклеотидного секвенационного праймера на одноцепочечной ДНК-матрице любого из фагов М13 серии и достройки второй цепи фрагментом Клёнова с участием меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов, реакцию останавливают добавлением соли. Если время инкубации выбрано таким образом, что удвоение цепи происходит не далее гена III, то вновь синтезированная цепь длиной до 4,5 т. п.н. содержит меченые нуклеотиды, а проксимальная часть генома фага М13 длиной 2,5 т. п.н., имеющая тандемные повторы, остается одноцепочечной. Это позволяет тандемному повтору гибридизоваться с комплементарными последовательностями ДНК, иммобилизованной на фильтре, и тем самым делает возможным использование меченой ДНК фага в качестве гибридизационной пробы. После освобождения от невключившихся меченых нуклеотидов можно измерить удельную активность ДНК-зонда, которая обычно варьирует в пределах 1–2ХЮ9 имп./мин/мкг ДНК матрицы. Однако, по-видимому, очистка зонда на колонке с сефадексом, снижает его гибридизационную активность, поэтому лучше избегать этого этапа и использовать в качестве зонда полученную реакционную смесь без дальнейшей ее очистки.


Прочие статьи:

Морфологическое строение представителей отряда
Скелет китов губчатый, пропитанный жиром. В позвоночнике от 41 до 98 позвонков, образующих 4 отдела: шейный (очень короткий, но всегда из 7 свободных или срощенных позвонком), грудной, поясничный и хвостовой. Грудной отдел несет 10—17 пар ...

Аспергиллы
Аспергиллы, так же как и пенициллы, относятся к классу несовершенных грибов. Естественное их местообитание – верхние горизонты почв, особенно в южных широтах, где их чаще всего обнаруживают на различных субстратах, главным образом растите ...

Транскрипция
В процессе транскрипции генов происходит биосинтез молекул РНК, комплементарных одной из цепей матричной ДНК, сопровождаемый полимеризацией четырех рибонуклеозидтрифосфатов (ATP, GTP, CTP и UTP) с образованием 3'–5'-фосфодиэфирных связей ...