Макроструктура клонированной вставки
Страница 2

г. Определение положения интересующего нас сегмента во вставке

Для определения положения сегментов в небольших рекомбинантных геномах используются те же подходы, что и при нахождении специфических сегментов в больших геномах до клонирования. После построения рестрикционной карты вставки установить точную локализацию нужного сегмента не составляет труда. Для этого нужен только подходящий меченый зонд, аналогичный ДНК - или РНК-зонду, используемому для отбора клона в начале клонирования.

Овальбумин-это белок, состоящий из одной полипептидной цепи; он синтезируется в яйцеводе курицы после стимуляции стероидным гормоном эстрогеном и накапливается в яичном белке. У кур-несушек стимуляция гормоном происходит в естественных условиях, а у цыплят образование яйцевода и синтез овальбумина индуцируются при введении эстрогена. Гормон индуцирует транскрипцию гена овальбумина, в результате чего содержание овальбуминовой мРНК в клетке увеличивается практически от нуля до 50000 молекул через две-три недели и падает до 10 молекул на клетку после прекращения воздействия эстрогена. Яйцеводы кур-несушек представляют собой хороший источник овальбуминовой мРНК, поскольку она составляет в них около 50% суммарной мРНК. Очищенную мРНК используют затем для приготовления радиоактивного зонда, применяемого для идентификации клонированного гена овальбумина. Зондом может служить радиоактивно меченная одноцепочечная кДНК, синтезированная непосредственно на мРНК с помощью обратной транскиптазы, или клонированная дуплексная кДНК. С помощью таких зондов из популяции Х-векторов, содержащих вставки геномной ДНК курицы, полученные при ограниченном гидролизе эндонуклеазой EcoRI, были отобраны клонированные последовательности овальбуминового гена. Вставка, имела длину 6,8 т.п. н. Из нее образовались три EcoRI-фрагмента, при этом только фрагмент длиной 2,35 т.п. н. отжигался с овальбуминовым кДНК-зондом.

Положение искомой последовательности в клонированном сегменте можно определить также с помощью электронной микроскопии. Для этого зонд и рекомбинантную ДНК смешивают, денатурируют и отжигают, а затем готовят препарат для микроскопирования. Комплементарные участки зонда и исследуемой молекулы образуют дуплексы, которые на электронных микрофотографиях выглядят как относительно толстые нити, а некомплементарные участки остаются одноцепочечными и имеют вид более тонких нитей. Гетеродуплекс, образующийся между овальбуминовым рекомбинантом формируются при условиях, благоприятных для гибридизации типа РНК'ДНК, а не ДНК'ДНК. В сегменте ДНК размером 2,35 т.п. н., который гибридизовался с мРНК, в образовании двухцепочечной структуры участвовали только около 550 п. н. Таким образом, гетеродуплексный анализ гораздо более информативен, чем определение положения кодирующих последовательностей в клоне. Он показывает, что, хотя мРНК содержит около 1800 п. н., в клонированном сегменте ДНК представлено менее трети длины кодирующих последовательностей гена овальбумина. Кроме того, 550 п. н. в клонированной ДНК, комплементарные мРНК, не образуют одну непрерывную последовательность, а распределены по четырем участкам, разделенным одноцепочечными петлями, т.е. кодирующие последовательности геномной ДНК чередуются с некодирующими. Как описано в разд.8.5, такие промежуточные последовательности, или интроны, типичны для эукариотических генов.

Страницы: 1 2 


Прочие статьи:

Характеристика бассейна р. Большая
Река Большая – наиболее мощная водная артерия западной Камчатки, а после р. Камчатка – и всего Камчатского полуострова. Река протекает с севера на юго-запад полуострова и впадает в Охотское море. Ее бассейн занимает площадь свыше 20000 км ...

Изоляция
Изоляция должна быть рассмотрена в числе прочих факторов образования рас у человека на основании следующих соображений. Прежде всего, можно считать установленным, что развитие первобытного общества прошло через очень продолжительную стади ...

Растения семейства розовых
Семейство РОЗОВЫЕ (rosaceae) ИЛИ РОЗОЦВЕТНЫЕ Семейство объединяет деревья, кустарники и травы с большей частью очередными, реже супротивными, простыми или сложными листьями, часто снабженными прилистниками. Цветки розовых актиноморфные, о ...