Изучение функций клонированных сегментов ДНК
Страница 2

Статьи » Продукты рекомбинации - характеристика и манипулирование » Изучение функций клонированных сегментов ДНК

тестированию на способность гибридизоваться с клонированной ДНК. Если РНК, идентифицированная с помощью клонированной ДНК, выделена из цитоплазмы и полиаденилирована, то скорее всего она представляет собой мРНК. Идентификация становится более надежной, если, кроме того, РНК связана с полисомами.

Еще одной характеристикой мРНК, гибридизовавшихся с клонированным сегментом ДНК, является их размер. Иногда РНК имеет больший размер, чем клонированный сегмент; это означает, что в клоне представлена лишь часть гена. В других случаях РНК оказывается короче клонированного сегмента, что свидетельствует о наличии в клонированной последовательности дополнительных последовательностей, не представленных в транскрипте. Это могут быть геномные последовательности, фланкирующие транскрибируемую область, или не-кодирующие последовательности, прерывающие кодирующую область и подвергающиеся сплайсингу во время созревания мРНК. Все эти взаимоотношения между клонированным сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК можно установить более точно, используя специфичные к одноцепочечным ДНК нуклеазы или осуществляя обратную транскрипцию.

Исследование родства между клонированным сегментом ДНК и внутриклеточной РНК с помощью ДНК-РНК-гибридизации и специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз. Эксперимент включает три этапа. На первом клонированный фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом и денатурируют. Можно также использовать одноцепочечную ДНК. На втором этапе ДНК гибридизуют с выделенной клеточной РНК в растворе в условиях, благоприятных для образования ДНК-РНК-гибридов. Любые последовательности ДНК, присутствующие в клонированном фрагменте, но не представленные в РНК, остаются одноцепочечными. Их удаляют с помощью нуклеазы, специфичной к одноцепочечной ДНК. И наконец, гибридные молекулы денатурируют и подвергают гель-электрофорезу. Размер образующейся радиоактивной ДНК определяют с помощью радиавтографии, сравнивая положение исследуемой ДНК с положением молекул ДНК известного размера.

Этот основной эксперимент можно проводить во многих разных вариантах, каждый из которых позволяет выявить свои особенности структуры РНК в зависимости от того, какая именно нуклеаза используется, является ли РНК суммарной или очищенной цитоплазматической ро1у-мРНК. Один из таких вариантов, где в ДНК имеется один протяженный участок, комплементарный РНК, и не спарены только концы молекулы. Метод позволяет также выявить любую область, где отсутствует комплементарность между РНК и ДНК. Во многих экспериментах такого рода используется специфичная к одноцепочечной ДНК эндонуклеаза S1, поэтому метод называют картированием.

81-картирование часто используют для установления соответствия между началом молекулы РНК и специфическим сайтом в клонированном сегменте ДНК. Во многих случаях этот сайт представляет собой сайт инициации транскрипции. Точность эксперимента значительно повышается, если используется небольшой ДНК-зонд, что позволяет измерить длину защищенного сегмента ДНК с точностью до одного нуклеотида. Для получения такого зонда обычно субклонируют строго определенные участки длинного фрагмента ДНК. Размер защищенного фрагмента ДНК определяют с помощью электрофореза в таких же гелях, что и при определении нуклеотидной последовательности.

Удлинение праймера: исследование родства между внутриклеточной РНК и клонированным фрагментом ДНК с помощью обратной транскриптазы. Для проведения этого эксперимента необходим относительно короткий ДНК-зонд, который гибридизуется с участком РНК, желательно находящимся на расстоянии не более 100 пар оснований от предполагаемого 5'-конца РНК. ДНК-зонд отжигают с РНК, и он играет роль праймера при обратной транскрипции, а матрицей служит РНК. Поскольку обратная транскриптаза прекращает копирование, когда достигает 5'-конца РНК, размер продукта позволяет установить, где начинается РНК. Обычно праймер бывает радиоактивно меченным, что позволяет легко определить положение продукта в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен только к конкретной РНК, исследуемый препарат может представлять собой смесь разных РНК.

б. Функциональное тестирование клонированной ДНК

Страницы: 1 2 3


Прочие статьи:

Царство грибов. Общая характеристика
Различаются по форме и размерам. Тело состоит из тонких нитей – гифов, образующих грибницу (мицелий). Царство грибов делится на подцарства: низшие (тело состоит из одной клетки) и высшие (многоклеточный мицелий). По способам питания: пар ...

Этнический и антропологический состав северной Азии
Основным по численности народом в Сибири являются русские. Массовое переселение русских за Урал началось в конце XVI в. и шло в последующие столетия из различных частей Европейской России. В ряде районов Сибири русские старожилы в значите ...

Этология сов. Взаимоотношение различных видов сов между собой
Во время наблюдений за отдельными парами сов, заселивших наши искусственные гнездовья, нами были отмечены также несколько случаев пересечения кормовых угодий различных пар сов одного или разных видов. Отчасти это было перекрывание с парам ...