Возможные ошибки и варианты методики
Страница 1

Некоторые линии клеток сливаются с трудом, если же все-таки необходимы именно такие комбинации, попытайтесь сделать следующее.

1. Варьируйте соотношение родительских клеток в диапазоне 1:10–10:1.

2. Попробуйте разный ПЭГ:

а) поменяйте партию ПЭГ. В наших экспериментах та партия ПЭГ, которая давала хорошие результаты при слиянии одного типа клеток, эффективно работала и с другими. Хорошо зарекомендовавший себя препарат необходимо отделить и аккуратно хранить. По некоторым данным свойства ПЭГ могут быть улучшены использованием растворов, не содержащих солей кальция;

б) варьируйте молекулярный вес. Как правило, повышение молекулярного веса влечет за собой увеличение способности индуцировать слияние. Однако раствор ПЭГ с большим молекулярным весом обладает большей вязкостью, что затрудняет отмывку клеток. Так как ПЭГ является

Для каждой конкретной клеточной линии необходимо подобрать оптимальную концентрацию колцемида и время экспозиции. Образование мини-клеток легко контролируется под фазово-контрастным микроскопом. В удачных экспериментах около 50% всех клеток образуют мини-клетки. Эта частота увеличивается после обработки цитохала-зином В.

Второй день

3. Спустя 16 ч замените среду на среду, содержащую цитоха-лазин В в концентрации 2 мкг/мл; инкубируйте в течение ночи.

4. Исходные градиентные растворы поместите в сосуды с неплотно завинченными крышками и инкубируйте в атмосфере 5% СОг при 37 °С в течение ночи.

5. Заранее нагрейте ротор SW41.

Третий день

6. Приготовление ступенчатого градиента фиколла. Тщательно промойте необходимое количество центрифужных пробирок для ротора SW41 абсолютным спиртом, высушите в перевернутом положении в ламинарном боксе. Приготовьте градиент фиколла, используя уравновешенные исходные растворы.

7. Соберите обработанные колцемидом и цитохалазином клетки и осадите их центрифугированием. Ресуспендируйте в 3 мл 10%-ного фиколла и мягко наслоите на градиент. Заполните центрифужные пробирки раствором без фиколла.

8. Поместите пробирки, содержащие градиент, в нагретый ротор SW41 и поставьте ротор в заранее нагретую до 37 °С ультрацентрифугу.

9. Центрифугируйте 1 ч при 25000 об/мин при 37 °С; используйте минимальное ускорение при разгоне и минимальное торможение, чтобы предотвратить разрушение градиента.

10. Выньте пробирки из центрифуги. Мини-клетки образуют рыхлые полоски в градиенте между 15:16% и 16:17% фиколлом. Осторожно отберите эти полоски, используя стерильную пастеровскую пипетку, вводя ее через верх градиента; поместите мини-клетки в новую, стерильную центрифужную пробирку от ротора SW41 и заполните ее средой для роста клеток. Загрязнение фрагментами цитоплазмы, ядрами и целыми клетками можно контролировать под фазово-контрастным микроскопом.

11. Центрифугируйте при 20 000 об/мин при комнатной температуре в роторе SW41 10 мин при максимальном ускорении и торможении. Эта процедура осаждает мини-клетки и отделяет их от фиколла.

12. Для дальнейшей очистки мини-клеток мы предлагаем три различных приема. Очистка не нужна, лишь когда в распоряжении исследователей имеется четкая система селекции. В этом случае они могут сразу использовать мини-клетки для слияния с клетками-реципиентами.

13. Слияние мини-клеток с целыми клетками. Соберите клетки-реципиенты и отмойте их бессывороточной средой. Добавьте приблизительно 107 клеток-реципиентов к осадку мини-клеток в 2 мл бессывороточной ростовой среды, содержащей 100 мкг/мл фитогемагглютинина. Поместите в пластиковый сосуд с коническим дном и инкубируйте 10 мин при 37 °С.

Страницы: 1 2


Прочие статьи:

Регуляторная модель старения
Центральным для жизни как таковой является процесс постоянного самообновления всех составных частей организма, что, по существу, тождественно определению жизни как таковой. Вполне логично представить, что уровень самообновления определяет ...

Фтор как химический элемент
Фтор – элемент из семейства галогенов, в которое входят также хлор, бром, йод и искусственно полученный радиоактивный астат. Обозначается символом F (лат. Fluorum). Фтору свойственны все особенности собратьев по подгруппе, однако он подоб ...

Болезни китообразных
Болезни и многочисленные паразиты сокращают продолжительность жизни китообразных. В неволе дельфины гибнут от острых воспалений печени, язвы желудка, эмфиземы и абсцессов легких, гнойной пневмонии, рожистых воспалений, стафилококковой инф ...